Termékek

Az a mód, ahogyan az egyidejű mutációk hatásai az enzimatikus aktivitás megváltoztatására kombinálódnak, nem könnyen megjósolható, mivel ezek a hatások nem mindig lineárisan additívak.Ezért a szubsztráthoz kötődő aminosavak egyidejű mutációinak hatásainak jellemzése jelentősen hozzájárulhat az enzimek szubsztrátspecifitásának megértéséhez.A Spodoptera frugiperda (Sfbetagly) béta-glikozidázában mind a Q39, mind az E451 kölcsönhatásba lép a szubsztráttal, és ez elengedhetetlen a szubsztrátspecifitás meghatározásához.A Sfbetagly kettős mutánsait (A451E39, S451E39 és S451N39) helyspecifikus mutagenezissel állítottuk elő, baktériumokban expresszáltuk, és affinitáskromatográfiával tisztítottuk.Ezeket az enzimeket p-nitrofenil-béta-galaktozid és p-nitrofenil-béta-fukozid szubsztráttal jellemeztük.A Q39 és E451 pozícióban helyirányított mutációkat tartalmazó Sfbetagly egyszeres és kettős mutánsok k cat/Km arányát használták annak bizonyítására, hogy a kettős mutációk (Gdouble) az ESdouble dagger (enzim-átmeneti állapot komplex) szabad energiájára gyakorolt ​​hatást. daggerxy) nem az egyes mutációkból (Gdouble daggerx és Gdouble daggery) származó hatások összege.Ez a különbség a Gdupla tőrben azt jelzi, hogy az egyes mutációk hatásai részben átfedik egymást.Ezért ez a közös hatás csak egyszer számít a Gdouble daggerxy-ben.A béta-glikozidázokra vonatkozó kristályos adatok egy kétfogú hidrogénkötés jelenlétét mutatják, amely a Q39 és E451 maradékokat és a szubsztrát azonos hidroxilcsoportját foglalja magában.Ezért mind a termodinamikai, mind a krisztallográfiai adatok arra utalnak, hogy a Q39 és E451 maradékok kölcsönösen befolyásolják a szubsztrátummal való kölcsönhatásaikat.